噬菌體篩選技術可以展示大量不同的多肽或蛋白質,這種豐富的多樣性為篩選提供了廣闊的空間,有助于發現目標分子的各種可能的特定結合配體或功能,大大增加了找到理想候選者的概率。即便相互作用較弱,噬菌體展示技術也能有效地進行篩選。這意味著即使是低親和力的結合也能被檢測到,從而提高了對目標的識別靈敏度,使得一些原本難以察覺的結合事件得以發現。
單輪篩選就能處理高達10PFU的噬菌體庫,能夠快速地從海量的噬菌體中富集到具有特殊性質的特異分子,提高了篩選效率,節省時間和資源。絲狀噬菌體可分泌到培養基中,通過簡單的離心加沉淀的方法就可以實現富集,無需復雜的蛋白純化步驟,簡化了實驗流程,降低了操作難度和成本。可以獲得天然表位的替代分子,有效解決了“天然表位難以表達”的問題,拓寬了研究和應用的范圍,為獲取具有特定功能的分子提供了新的途徑。
噬菌體篩選是一種重要的生物技術手段,以下是其測定步驟:
1.準備階段
-構建噬菌體展示文庫:從B淋巴細胞中提取mRNA,通過反轉錄生成cDNA,利用PCR技術擴增抗體的可變區,將這些可變區基因克隆到噬菌體載體中,轉化宿主細菌,產生展示各種抗體的噬菌體。
-質量控制:對文庫進行質量檢查,包括確認文庫的多樣性、插入率和庫容量。同時,準備足夠的目標抗原,可以是純化的蛋白質、肽段或固定在固相表面上的細胞。
2.篩選過程
-吸附(Binding):將噬菌體展示文庫與固相抗原孵育,使特異性抗體與抗原結合,未結合的噬菌體則被洗去。
-洗脫(Elution):使用適當的方法如競爭性配體、改變pH值或特定洗脫劑,從固相表面洗脫結合的噬菌體。
-擴增(Amplification):將洗脫的噬菌體感染宿主細菌,以指數方式擴增結合的噬菌體。一般在細菌培養基中培養,然后收集并準備下一輪篩選。
3.多輪篩選
-為提高抗體的特異性和親和力,通常需進行多輪篩選。每輪篩選后對噬菌體進行擴增,以便進行下一輪更嚴格的篩選。隨著輪次增加,非特異性結合的噬菌體會逐漸被淘汰,而特異性結合的噬菌體將被富集。
4.鑒定和驗證
-篩選結束后,對富集的噬菌體進行鑒定和驗證。通常涉及對噬菌體DNA進行測序,確定抗體基因的序列;還可在體外表達這些抗體,并使用ELISA、Western blot等生物學方法驗證其特異性和親和力。
5.親和力成熟(可選)
-若需要進一步提高抗體性能,可進行親和力成熟操作,如通過定向進化、隨機突變或使用酵母表面展示等技術來實現。